在斑点杂交中，要检测到的生物分子不是首先通过电泳分离出来的，相反，将含有被检测分子的混合物直接点在膜上，烘烤固定。然后与m6A或Ac4C抗体(Western blot)杂交后检测，步骤如下：
（1）交联：在65℃下5分钟,使mRNA变性以破坏RNA中的二级结构。变性后立即在冰上冷却，以防止mRNA的二级结构重新形成。将2 μl的mRNA直接滴加到Immobilon-Ny+尼龙卷膜上，在紫外线交联剂中进行交联。轻轻振荡5分钟，洗涤未结合的mRNA。
（2）封闭：在室温下温和摇动，将膜在10 ml封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）中孵育1小时。
（3）一抗孵育：将膜置于5ml抗体稀释缓冲液（1:250稀释; 2 μg/ml）中，于4℃温和摇动过夜孵育膜。
（4）清洗：于洗涤缓冲液中轻轻洗涤3此，每次5分钟。
（5）二抗孵育：将膜置于5ml Goat anti rabbit IgG-HRP（1：10,000稀释; 20 ng/ml）二抗稀释缓冲液中，在室温下温和摇动孵育膜1小时。
（6）清洗：于洗涤缓冲液中轻轻洗涤3此，每次10分钟。
（7）在室温下在黑暗中将3 ml Western Blotting底物孵育5分钟。于天能全自动化学发光图像分析系统记录斑点印迹结果。
【实验服务流程】
