Dot Blot检测采用NC膜，取NC膜裁成6.5cm宽长条，并在其上画长宽为1cm×1cm正方形小格（在膜上面的蓝色纸上画，画格时膜（白色）与蓝色纸必须完全重叠，让蓝色纸上的正方形小格能在膜上留下正确的划痕）。

将不同浓度的多肽稀释为成50ng/ul（稀释为需要的浓度即可）。

揭开膜上面的蓝色保护纸，用移液器吸取50ng/μL多肽稀释液2ul点在膜上1cm×1cm正方形小格中心，即多肽包被量为100ng（包被量根据需求调整）。点样完成后，将NC膜放入37℃烘箱中30min。

把膜放入相应的大小的抗体孵育容器中，加入适量Blocking Buffer室温封闭1h。

封闭结束10min前，用Antibody Dilution Buffer稀释一抗备用。封闭结束后去除封闭液，加入稀释好的一抗工作液，室温2h或4℃过夜。

去除一抗工作液，加入适量TBST Buffer洗杂4次，5min/次。

洗杂结束前10min，用Antibody Dilution Buffer稀释二抗备用。去除TBST Buffer，加入稀释好的二抗工作液，室温1h。

去除二抗工作液，加入适量TBST Buffer洗杂4次，5min/次。

• a. 根据膜的大小，按1cm*1cm的膜使用 20ul工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
• b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均有覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
• c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟，然后一起显影定影观察结果。
• d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。