Mol Cancer成果|教您如何发外泌体10分文章
发布者：小编发布时间：2021-12-13 20:52
（1）受辐射的垂死肿 瘤细胞释放的外泌体可动态增强肿 瘤的繁殖
作者进一步探讨了外泌体对胰腺ai的作用，作者在胰腺ai异种移植（PDX）小鼠模型中进行了体内实验。发现辐照的PDX肿 瘤能加速种群重现（图1h）。当PDX小鼠同时用GW4869（外泌体抑 制剂）治 疗时，肿 瘤的种群显着减慢（图1h），小鼠的生存时间延长了（图1i）。这些结果表明，垂死的肿 瘤细胞来源的外泌体促进了肿 瘤的重新聚集。图1：受辐射的垂死肿 瘤细胞释放的外泌体可以动态增强肿 瘤的繁殖
作者认为肿 瘤再生细胞（TRC）可能是外泌体的主要受体。由于目前没有办法鉴定TRC，因此作者收集了放射后存活的胰腺ai细胞，并通过高通量测序分析了ai症干细胞相关基因的表达谱。发现与未辐射的对照组相比，有62个基因表达被上调， 值得注意的是，辐射后ALDH1A1的表达显着上调（图2a）。众所周知，ALDH1A1是胰腺ai干样细胞重要的标志物之一。ALDEFLOUR™实验表明，放射后存活的ai细胞和原发性胰腺肿 瘤细胞中ALDH +细胞的比例显着提高（图2b-c）。qPCR分析和Western印迹表明，ALDH1A1的表达在受辐照的胰腺ai细胞和PDX肿 瘤组织中表达上调（图2d）。免疫组织化学（IHC）染色进一步显示，ALDH1A1+细胞在PDX肿 瘤组织中照射后高度富集（图2e）。但是，GW4869显 著抑 制了ALDH1A1+细胞的积累（图2e），这表明外泌体可能会促进ALDH1A1 +细胞的存活。
（3）外泌体通过促进DNA损伤反应增强TRC的存活
此外，作者还探究了外泌体是否能直接促进体外辐射存活TRC的DDR。如示踪细胞所示，辐射在ALDH1A1+和ALDH1A1-细胞中均引起DNA损伤（图3c）。GW4869显 著损害了ALDH1A1+细胞的修复，因为它们中的大多数在放射后3天仍携带γH2A.X阳性灶（图3c）。此外，来自辐射的垂死肿 瘤细胞的外泌体显 著加速了γ-H2A.X和pATM的衰减（图3d）并降低了辐射细胞中DNA损伤（图3e）。总体而言，这些结果表明，受辐射的垂死的肿 瘤细胞来源的外泌体通过促进DDR增强了TRC的存活。图3：外泌体通过促进DDR增强TRC的存活
作为外泌体的重要内含物，作者推断miRNAs可能在TRC的存活中起重要作用。因此，作者进行了对辐射前后的肿 瘤细胞外泌体进行了外泌体miRNA测序（本实验君礼提供），发现在垂死的肿 瘤细胞来源的外泌体中，两个重要的miRNA，即miR-196b-5p和miR 194-5p显着上调（图4a）。前人研究表明，miR-194可能参与基因组稳定性。因此，作者将其作为目标分子，通过qPCR分析验证了miR-194-5p在外泌体中的高表达（图4b）。同样，miR-194-5p mimics转染的细胞在辐射后具有更强大的集落形成能力（图4d）。此外，当使用强力霉素处理时，胰腺ai细胞的集落形成被显 著抑 制。但是，如果强力霉素诱导后的胰腺ai细胞暴露于辐射中，则这些细胞的集落形成将显 著增强（图4e）。此外，miR-194-5p mimics在辐射的胰腺ai细胞中显 著促进了γH2A.X和pATM的衰减（图4f）和DNA损伤的减少。这些结果表明，外泌体miR-194-5p通过促进DDR促进了TRC的存活。先前的研究确定HMGA2和E2F3是胰腺ai的八个主要调节枢纽中的两个， 作者发现HMGA2负调控miR-194-5p的表达（图4j），并通过一系列实验证明，HMGA2富含茎状ALDH1A1+细胞，并且有助于胰腺ai的进展。但是，当胰腺ai细胞暴露于10Gy辐射时，HMGA2的过表达显 著抑 制了这些细胞的集落形成能力（图4k），而敲除HMGA2则增强了细胞存活和集落形成（图4l）。HMGA2还阻碍了辐射的胰腺ai细胞中pATM和γH2A.X的衰减（图4m）和DNA损伤。总之，这些数据表明，TRC中富集的HMGA2促进了干细胞的生长和ai症进展，但潜在地损害了辐射的TRC的存活和恢复，而来自垂死的肿 瘤细胞的外泌体miR-194-5p瞬时逆转了辐射下HMGA2的作用。图4：外泌体miR-194-5p促进受损TRC的修复
如前所述，垂死的肿 瘤细胞能促进报告细胞的增殖，这暗示着TRCs被除了外泌体miR-194以外的物质驱使加速了增殖。众所周知，受辐射的垂死肿 瘤细胞还释放了PGE2，这是一种脂质代谢产物，被认为是化学放疗后肿 瘤重生的重要介质。因此，作者通过ELISA定量了受辐射的垂死胰腺ai细胞中的PGE2，发现放射后24小时PGE2含量保持不变，但在48小时略有升高，而在72小时显 著增加（图5a）。同时，发现 celecoxib（一种抑 制PGE2合成的COX-2抑 制剂）以剂量依赖性方式显 著抑 制了肿 瘤细胞的繁殖（图5e）。虽然PGE2可以加速肿 瘤细胞的增殖，但是在放射后立即向肿 瘤细胞中添加PGE2会反向抑 制细胞活力（图5f）。值得注意的是，celecoxib处理并不会影响外泌体相关标志蛋白质的表达（图5g）。这些结果表明，辐射的垂死肿 瘤细胞分泌的外泌体对于肿 瘤的再形成至关重要。（6）阿司匹林通过削弱垂死的肿 瘤细胞的分泌物来抑 制放疗后的肿 瘤
接着，作者又在PDX小鼠模型中测试了阿司匹林治 疗的效果。阿司匹林单一疗法对PDX肿 瘤无治 疗作用，单独放疗同样无治 疗作用（图6h-i）。然而，阿司匹林治 疗和放射疗法的结合显 著抑 制了肿 瘤的重新聚集并延长了荷瘤小鼠的存活时间（图6h-i）。此外，阿司匹林损害了放疗后肿 瘤组织的恢复，这与GW4869的作用相似。同时，阿司匹林还抑 制了放疗后肿 瘤组织中ALDH1A1+ TRC的富集。这些数据表明，阿司匹林可抑 制胰腺ai放疗后的肿 瘤再增殖。图6：阿司匹林通过削弱垂死的肿 瘤细胞的分泌物来抑 制放疗后的肿 瘤
