乳酸 ( Lactate )是细胞糖酵解途径重要的含碳代谢产物，在肿瘤细胞中Warburg效应中具有重要作用。乳酸化修饰( lactylation，Kla )是2019年芝加哥大学赵英明教授课题组在Nature杂志报道的全新蛋白质翻译后修饰类型^[1]。

在“writer”组蛋白乙酰基转移酶p300作用下，使组蛋白发生乳酸化修饰 (Kla)，调控免疫激活过程中巨噬细胞极化相关基因表达^[2]。

后续研究进一步证实，蛋白质乳酸化修饰是乳酸发挥功能的重要方式，参与糖酵解相关细胞功能、神经系统调控、巨噬细胞极化等重要过程^[3,4]。

下面我们以东田纳西州立大学李传富（Chuanfu li）团队于2021年8月在Cell Death & Differentiation发表题为"Lactate promotes macrophage HMGB1 lactylation, acetylation,and exosomal release in polymicrobial sepsis"的研究论文为参考文献^[5]，对乳酸化修饰的研究手段进行讨论。

一、简介

脓毒症是一种对感染反应失调导致的器官功能障碍综合症，血清乳酸被认为是脓毒症预后的生物标志物，血清乳酸水平升高与脓毒症死亡率呈正相关。HMGB1是一种普遍存在的核蛋白，可由活化的巨噬细胞释放，以协调炎症反应。临床证据表明，循环HMGB1水平显著升高，并与脓毒症的严重程度和死亡率呈正相关。本研究探讨了乳酸是否能促进多微生物脓毒症期间巨噬细胞中HMGB1的乳酸化和乙酰化。

二、结果

临床证据表明，高血清乳酸水平与脓毒症患者的活动度和死亡率相关。与脓毒症对照小鼠相比，给脓毒症小鼠服用乳酸后，血清乳酸水平显著升高44%（图1A），HMGB1水平显著升高63%（图1B），而脓毒症小鼠（图1C）的存活率显著降低。相反，通过特定LDH抑制剂恶氨酸钠抑制乳酸生成，显著减轻CLP脓毒症，增加HMGB1（图1D）和乳酸（图1A）的血清水平，从而改善脓毒症小鼠的生存结果（图1C）。这些数据表明，乳酸在脓毒症增加血清HMGB1水平和死亡率中起着重要作用。图1E显示，与假对照组相比，CLP脓毒症显著增加了HMGB1的血清水平。

图1乳酸水平升高有助于多微生物脓毒症患者循环外体HMGB1水平升高

先前的研究表明，活化的巨噬细胞是炎症期间分泌HMGB1的主要来源之一。乳酸给药进一步促进了LPS刺激的巨噬细胞中HMGB1的细胞质定位（图2A），而草氨酸对内源性乳酸产生的抑制减弱了LPS诱导的巨噬细胞中HMGB1的细胞质积聚（图2B）。

这些数据表明，乳酸可以诱导HMGB1在细胞质中积累，并促进其定位到溶酶体，然后通过外泌体分泌释放。

图2乳酸通过巨噬细胞外泌体分泌诱导HMGB1胞浆积累和释放 

图3乳酸直接诱导巨噬细胞HMGB1乳酸化（Klac）

为了深入了解乳酸是否也能促进HMGB1乙酰化释放，我们在乳酸治疗后通过免疫沉淀检测HMGB1中赖氨酸乙酰化（Kac）水平。

如图4A所示，乳酸处理显著增加HMGB1免疫复合物中的Kac，表明乳酸促进HMGB1赖氨酸乙酰化。使用特定的抗乳酸HMGB1抗体，我们观察到在乳酸刺激下HMGB1中赖氨酸12和29残基的乙酰化水平增加（图4B）。

这些数据表明乳酸刺激HMGB1乙酰化，并促进HMGB1从巨噬细胞的细胞核转移到细胞质。

图4乳酸诱导HMGB1乙酰化

数据表明，乳酸处理显著降低巨噬细胞中细胞质和核SIRT1的水平（图5A），表明SIRT1可参与乳酸诱导的HMGB1乙酰化。事实上，特异性SIRT1脱乙酰酶抑制剂selisistat（EX527）对SIRT1脱乙酰酶活性的抑制显著增加了HMGB1乙酰化（图5B）。

这些数据表明，乳酸抑制SIRT1脱乙酰酶的表达，从而使巨噬细胞中HMGB1乙酰化/脱乙酰化的平衡向乙酰化方向倾斜。

图5乳酸通过YAP介导的对巨噬细胞脱乙酰酶SIRT1的抑制促进HMGB1乙酰化

接下来，研究了给予乳酸后赖氨酸乙酰化酶的表达，并观察到乳酸处理显著增加了p300的转录水平（图6A），并增加了p300和CBP的胞浆和核蛋白水平（图6B）。如图6D所示，抑制p300/CBP乙酰化酶活性显著减弱了乳酸诱导的细胞溶质中乙酰化HMGB1水平的增加。

图6乳酸通过巨噬细胞中乙酰化酶p300/CBP的β-arrestin2依赖性招募促进HMGB1乙酰化

为了研究GPR81在乳酸诱导的HMGB1乙酰化中的作用，我们在乳酸治疗前2小时用GPR81拮抗剂3-羟基丁酸（3-OBA）治疗巨噬细胞。

图7A显示，GPR81抑制减弱了乳酸诱导的巨噬细胞中β-arrestin2、p300和CBP的核积聚。GPR81抑制还可阻止乳酸诱导的LATS1和YAP磷酸化，并保留巨噬细胞中YAP的表达（图7B）。

总之，这些数据证明GPR81通过β-arrestin2介导的p300/CBP乙酰化酶的招募和YAP依赖性抑制细胞核中SIRT1脱乙酰化酶，在乳酸促进的HMGB1乙酰化中发挥重要作用。

图7乳酸诱导的HMGB1乙酰化由GPR81信号传导介导

此外，乳酸处理的巨噬细胞的外质体显著增加了内皮细胞的通透性，而对照巨噬细胞的外质体没有这种作用（图8B）。相反，在外小体富集之前，巨噬细胞中HMGB1的特异性siRNA沉默（图8C）可保护HMGB1免受外小体HMGB1的影响，从而降低VE钙粘蛋白和Claudin 5的表达，外小体HMGB1可诱导内皮细胞中ICAM1的表达。

图8巨噬细胞源性外体HMGB1诱导内皮功能障碍

三、结论

研究证明了乳酸通过巨噬细胞外泌体分泌促进HMGB1乳糖化/乙酰化和释放的新作用。乳酸通过向HMGB1的赖氨酸残基引入丙交酯基直接参与HMGB1的丙交酯化，赖氨酸残基取决于p300乙酰化酶的活性。

然后，乳酸化/乙酰化HMGB1从细胞核转移到细胞质，然后通过外泌体分泌释放到循环中，分泌的外体HMGB1进一步破坏内皮细胞的完整性并增加血管通透性。

综上所述，该研究通过促进HMGB1的释放，为乳酸在脓毒症期间的有害作用提供了新的机制基础。数据表明，糖酵解衍生的乳酸和乳酸相关信号可能是抑制巨噬细胞释放HMGB1和改善多微生物脓毒症生存结果的潜在靶点。

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脓毒症动物模型实验：https://mp.weixin.qq.com/s/YVGuJS0tQ1r8ICpV06pI6Q

参考文献

［1］ Zhang D, Tang Z, Huang H, Zhou G, Cui C, Weng Y, Liu W, Kim S, Lee S, Perez-Neut M, Ding J, Czyz D, Hu R, Ye Z, He M, Zheng YG, Shuman HA, Dai L, Ren B, Roeder RG, Becker L, Zhao Y. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019; 574 (7779):575-580.

［2］ Liberti MV, Locasale JW. Histone Lactylation: A New Role for Glucose Metabolism. Trends Biochem Sci. 2020; 45 (3):179-182.

［3］ Hagihara H, Shoji H, Otabi H, Toyoda A, Katoh K, Namihira M, Miyakawa T. Protein lactylation induced by neural excitation. Cell Rep. 2021; 37 (2):109820.

［4］ Yu J, Chai P, Xie M, Ge S, Ruan J, Fan X, Jia R. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 2021; 22 (1):85.

［5］ Yang K, Fan M, Wang X, Xu J, Wang Y, Tu F, Gill PS, Ha T, Liu L, Williams DL, Li C. Lactate promotes macrophage HMGB1 lactylation, acetylation, and exosomal release in polymicrobial sepsis. Cell Death Differ. 2022; 29 (1):133-146