01
简 介
研发人员发现在许多癌症中，例如PDAC（导管胰腺癌）和MCC（默克细胞癌），STING（干扰素基因刺激蛋白）是被沉默掉的。当前，包括PD1/PDL1，CTLA-4抑制剂在内的一些肿瘤治疗方法在试图攻克侵袭性癌症（aggressive cancers），例如PDAC和MCC，但是都无法产生持续的治疗效果，而且还会产生耐受治疗的情况。处于免疫抑制状态的肿瘤一直是癌症治疗的难题。因此，急需探索新型治疗手段来应对此类致死性的癌症。
激活肿瘤细胞内的STING信号通路可以将“冷”肿瘤微环境转为“热”肿瘤微环境，也就是将肿瘤组织所处的免疫抑制环境转变为免疫激活环境。在本研究中，我们应用mRNA脂质纳米粒（LNP）向PDAC和MCC细胞中传递永久活性增益功能的STING-R284S突变体。本文表明，STING-R284S的mRNA-LNP传递可以探索作为一种新的治疗工具，在重启抗肿瘤免疫反应的同时，克服传统STING 激动剂的毒性和限制性，这将有望成为治疗那些缺乏STING信号通路的癌症的有效手段。
STING信号通路
STING是天然免疫反应和抗肿瘤反应中非常重要的调控因子。经典的STING信号通路可以识别死细胞、肿瘤细胞以及病原体释放的dsDNA，线粒体DNA。这些dsDNA会被cGAS（环化GMP-AMP合成酶）识别，同时合成能够结合并且激活STING的2‘-3’cGAMP。在受到病原体相关模式分子（PAMPs）或者损伤相关的模式分子（DAMPs）刺激后，STING激活I型或者III型干扰素（IFNs）和促炎细胞因子的转录，起始天然免疫反应。在癌症细胞中，经常存在大量的损伤DNA。这些损伤DNA会刺激产生依赖STING信号通路诱导的IFNs和抗肿瘤细胞因子/趋化因子（CXCL10和CCL5）。IFNs会刺激抗肿瘤T细胞的增值、对肿瘤组织侵润渗透以及直接杀伤，而CXCL10和CCL5对于募集肿瘤反应活性的T细胞具有非常重要的作用。
因此，激活STING信号通路被证明是一种转变肿瘤微环境的非常有前景的治疗手段，能够把免疫抑制状态的“冷”肿瘤微环境转变为免疫激活状态的“热”肿瘤微环境
“冷”肿瘤
肿瘤免疫抑制一直是癌症免疫治疗的大难题，给许多恶性肿瘤的临床治疗带来巨大挑战。98%的胰腺癌患者对于PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法是耐受的。几乎没有任何有效的治疗手段来对付晚期胰腺癌。胰腺癌细胞会处于一种高度免疫抑制的肿瘤微环境，从而抑制免疫系统的攻击和抵抗免疫疗法，因此将这种类型的肿瘤划归为不具有免疫原性的“冷肿瘤”。一般来说，能够侵润肿瘤组织的CD8+毒性T细胞和病人的存活能力直接相关。然而，大多数胰腺癌患者的肿瘤微环境中缺乏具有侵润能力的效应CD8+T细胞。研发人员发现，在许多癌症中，例如导管胰腺癌（PDAC）和合默克细胞癌（MCC）STING被沉默或者表达下调。
02
结果与讨论
研究发现，STING在MCC和其他几种癌细胞中没有表达，包括许多PDAC细胞系。首先分析了几个PDAC细胞系和患者病变中的STING蛋白水平（图1）。
从细胞系分析中可以发现，与原代人真皮成纤维细胞（HDF）相比，STING蛋白在AsPC-1、PANC-1和Capan-1细胞中稀少，在MIA PaCa-2中几乎检测不到。相反，在所有受试细胞系中都能清楚地检测到周期性GMP-AMP合成酶（cGAS）的水平，cGAS是STING的上游激活剂（图1A）。
图1：在PDAC中STING被下调。（A） 使用指示抗体对PDAC细胞和原代HDF细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹。GAPDH用作加载控制。（B）PDAC病变进行STING（绿色）和CK19（红色）染色，并用DAPI复染。显示了来自7名不同患者的胰腺病变的染色结果。
图2：高效STING获得功能突变体的鉴定。（A）稳定表达STING-WT、STING-V147L、STING-N154S、STING-V155M或STING-R284S的MIA PaCa-2细胞用或不用5µg/mL dox处理48小时。对细胞进行STING染色（红色）和切割的Caspase-3染色（绿色）。（B） 稳定表达STING-WT、STING-V147L、STINGN-154S、STING-V155M或STING-R284S的MIA PaCa-2细胞用或不用5µg/mL dox处理。在治疗后96小时，通过滴度GLO 3D细胞活性测定测定细胞活性（ns：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
然后，研究着手建立一种新的方法，利用STING获得功能的基因突变，在STING沉默的癌症中重新激活STING信号通路。为了筛选这些STING获得功能突变体抑制肿瘤增殖的能力，构建了稳定表达强力霉素（dox）诱导的野生型（WT）STING的MIA PaCa-2细胞或者是一个毒刺突变体。STING-R284S突变体在MIA PaCa-2细胞中的表达显著增加早期细胞死亡标记物切割caspase-3的表达（图2A），并抑制细胞增殖，可能通过增加经历细胞死亡的细胞数量（图2B）。相反，STINGWT和其他STING攻能获得突变体的表达并没有诱导这种效应。值得注意的是，所有功能突变体的STING增益显示出比WT STING更低的信号（图2A）。
dox处理可有效诱导两种稳定细胞系中的表达（图3A-B、图S1A-B）。与STING-WT相比，dox诱导的STING-R284S刺激STING下游抗肿瘤细胞因子的表达，如CCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFNb和TNF（图a3C、图S1C）。此外，与未诱导的细胞和表达dox诱导的STING-WT的细胞相比，STINGR-284S的表达增加了切割的caspase-3的水平（图3A、图S1A），并显著抑制了这些癌细胞的增殖（图3D、图S1D）。
图S1：dox诱导的STING-R284S的异位表达刺激PDAC细胞中关键的抗肿瘤细胞因子的产生和癌细胞死亡。（A-C）稳定表达STING-WT或STING-R284S的BxPC-3细胞用或不用5µg/mL dox处理24小时。（A）对细胞进行STING染色（红色）和切割的Caspase-3染色（绿色）。（B） 通过RT-qPCR证实STING-WT和STING-R284S的表达。（C） 通过RT-qPCR测量所示基因的mRNA水平，并将其标准化为GAPDH mRNA水平。未经处理的STINGWT细胞的值设置为1。（D） 稳定表达STING-WT或STING-R284S的BxPC-3细胞用或不用5µg/mL Dox处理。在治疗后72小时，通过滴度GLO 3D细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
病毒载体不能用来携带“热”STINGR284突变体，因为STING信号通路的激活阻止了许多病毒衍生载体的包装。
另一方面，mRNA-LNP已成为在癌细胞中传递基因表达的有力工具，也是强辅助性T细胞1（Th1）偏向的佐剂。作为测试这一策略的第一步，我们生成了编码STING-R284S和STING-WT的mRNAs，并将它们转染到PDAC细胞中。与模拟转染细胞相比，在STING-WT和STING-R284S-mRNA转染的PDAC细胞中检测到强烈的STING表达（图4A-B、图S2A-B）。
然而，只有STING-R284S-mRNA而不是STING-WT-mRNA刺激抗肿瘤细胞因子的产生，如bCCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFN和TNF（图4C、图S2C）。此外，与STING-WT-mRNA不同，STING-R284S-mRNA的转染显著提高了切割的caspase-3水平，并显著降低了癌细胞的增殖率（图4A、4D、S2A、S2D）。这些结果表明，转染STING-R284S-mRNA可以特异性地刺激STING信号通路，产生必需的抗肿瘤细胞因子并杀死癌细胞。
图4：转染STINGR-284S-mRNA可激活重要的抗肿瘤细胞因子的产生并触发PDAC细胞死亡。（A-C）用0.5µg STING-WT或STING-R284S-mRNA转染10e4 MIA PaCa-2细胞。转染后15小时，对细胞进行STING（红色）和切割的Caspase-3（绿色）染色（A），通过RT-qPCR（B）确认STING-WT和STING-R284S的表达，并检测STING-WT和STING-R284S的mRNA水平所示基因通过RT-qPCR进行测量，并标准化为GAPDH mRNA水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA转染0.5x10e4 MIA PaCa-2细胞。转染后15小时，通过滴度GLO 3D细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
图S2：转染STING-R284S-mRNA可激活重要的抗肿瘤细胞因子的产生并触发PDAC细胞死亡。（A-C）BxPC-3细胞转染，0.5µg STING-WT或STING-R284S-mRNA。转染后15小时，对细胞进行STING（红色）和切割的Caspase-3（绿色）（A）、STINGWT和STING-R284S染色，通过RT-qPCR（B）确认表达，通过RT-qPCR测量所示基因的mRNA水平，并将其标准化为GAPDH mRNA水平（C）。 未处理细胞（模拟）的值设置为1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S- mRNA转染BxPC-3细胞。转染后15小时，细胞活力为通过滴度GLO 3D细胞活力测定进行测定。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
为了进一步开发一种治疗方法，我们测试了LNP是否可以将STINGR-284S -mRNA传递到癌细胞中。然而，我们没有观察到STING-WT和STING-R284S在分别用mRNA LNP处理的MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中的显著表达（图5A和S3A，第2、5行）。我们测试了将STING-WT或STING-R284S -mRNA -LNP与APOE4混合是否能够促进mRNA向PDAC细胞的传递。我们发现，APOE4以剂量依赖性的方式强烈刺激mRNA LNP向PDAC细胞的传递（图5A、图S3A）。与未经处理的细胞相比，在用mRNA LNP和APOE4组合处理的细胞中，通过RT-PCR检测到更高水平的STING-WT和STINGR-284S -mRNA（图5B，图S3B）。与仅使用STING-WT -mRNA的治疗相比，STING-R284S -mRNA LNP和APOE4的联合治疗也显著增强了关键抗肿瘤细胞因子的表达，如CCL5、CXCL10、IL29、IL6和TNF（图5C、图S3C）。
此外，LNP递送的STING-R284S -mRNA不仅诱导PDAC细胞产生裂解的caspase-3，而且还显著抑制这些细胞的增殖（图5A、5D、S3A、S3D）。重要的是，相同的治疗没有抑制CD8+T细胞的增殖（图S3E）。
图5：由mRNA LNP传递的STING-R284S激活必需的抗肿瘤细胞因子的产生并杀死PDAC细胞。（A） 用1µg STING-WT或STING-R284S- mRNA LNP处理2x10e4 MIA PaCa-2细胞，将其与指定浓度的重组人APOE4蛋白预混合。转染后16小时，对细胞进行STING染色（红色）和切割的Caspase-3染色（绿色）。（B-C）10e4 MIA PaCa-2，如（A）所示，使用10µg/ml人APOE4蛋白处理细胞。转染后16小时，通过RT-qPCR（B）确认STINGWT和STINGR284S的表达，并通过RT-qPCR测量所示基因的mRNA水平，并将其标准化为GAPDH mRNA水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为1。（D） 0.5x10e4 MIA-PaCa-2细胞按（B）处理。转染后16小时，通过滴度GLO 3D细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
图S3：由mRNA LNP传递的STINGR284S激活必需的抗肿瘤细胞因子的产生并杀死PDAC细胞。（A） 10e4 BxPC-3细胞用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA LNP，与指定浓度的重组人APOE4蛋白预混合。转染后16h，细胞对STING（红色）和切割的Caspase-3（绿色）进行染色。（B-C）用1µg STING-WT或STING-R284S- mRNA- LNP处理10e4 BxPC-3细胞，这些LNP与10µg/ml人APOE4蛋白预混合。转染后16h，通过RT-qPCR（B）证实STING-WT和STING-R284S的表达，并且所示基因通过RT-qPCR进行测量，并标准化为GAPDH mRNA水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP处理0.5x10e4 BxPC-3细胞，其与10µg/ml APOE4蛋白。转染后16h，通过滴度GLO 3D细胞活力测定测定细胞活力。（E） 10e4 CD8+T细胞用1µg STING-WT或STING-R284S mRNA LNP处理，其与10µg/ml APOE4蛋白预混合。转染后16h，通过滴度GLO 3D细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
我们之前的研究表明，STING在MCPyV+MCC细胞系中受到特异性抑制。通过分析已发表的RNA序列数据，我们发现在MCPyV-MCC细胞系UISO中表达，在所有六种经典MCPyV+MCC细胞系中几乎检测不到STING RNA表达水平：MKL-1、MKL-2、MS-1、WaGa、PeTa和BroLi（图S4A）。RNA-seq数据还表明，与其他MCPyV+MCC细胞系相比，PeTa细胞中STING RNA的表达略高（图S4A）。然而，Western blot分析显示，与MKL-1细胞类似，PeTa细胞中的STING蛋白表达完全不易察觉（图S4B）。因此，这项研究证实，在我们检测的所有经典MCPyV+MCC细胞系中，STING表达均受到抑制。
图S4：STING在经典的MCPyV+MCC细胞系中沉默。（A） 根据公布的RNA-seq数据计算MKL-1、MKL-2、MS-1、WaGa、PeTa、BroLi和UISO细胞中STING的mRNA水平（HTseq计数）[87]。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001），（B） 使用指定抗体对PeTa、MS-1、UISO、MCC13和原代HDF细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹。GAPDH用作加载控制。
在PDAC细胞中观察到的STING-R284S-mRNA-LNP的抗肿瘤活性的鼓舞下，我们测试了我们的LNP方法是否可以用于刺激MCC细胞也有同样的阳性反应。我们首先使用萤火虫荧光素酶mRNA LNP优化MCC细胞的mRNA LNP输送条件。我们确定10 ug/ml的人载脂蛋白E4也是将mRNA LNP导入MCC细胞的理想浓度（图S5）。
与未经处理的MKL-1和MS-1 MCC细胞相比，STING-WT和STING-R284S- mRNA- LNP处理的细胞中均检测到强烈的STING表达（图6A-B、S6A-B）。然而，只有STING-R284S-mRNA-LNP的输送，而不是STING-WT-mRNA-LNP的输送，刺激关键抗肿瘤细胞因子CCL5、CXCL10、IL29、IL6、IFN和TNF的b表达（图6C、S6C）。与STING-WT相比mRNA-LNP，用STING-R284S-mRNA-LNP处理MCC细胞，也提高了切割的caspase-3水平，并大大抑制了细胞增殖（图6A、6D、S6A、S6D）。这些结果表明，STING-R284S-mRNA-LNP也能诱导受试MCC细胞系的抗肿瘤细胞因子表达和细胞死亡。
图6：STINGR-284S-mRNA-LNP可触发MCC细胞中重要的抗肿瘤细胞因子的产生和细胞死亡。（A） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP处理10e4 MKL-1细胞，将其与指定浓度的重组人APOE4蛋白预混合。转染后16h，对细胞进行STING染色（红色）和切割的Caspase-3染色（绿色）。（B-C）10e4 MKL-1细胞被处理为在（A）中，使用10µg/ml人APOE4蛋白。转染后16小时，通过RT-qPCR（B）确认STING-WT和STING-R284S的表达，并通过RT-qPCR测量所示基因的mRNA水平，并将其标准化为GAPDH mRNA水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为1。（D） 0.5x10e4 MKL-1电池，在转染后40小时，通过滴度GLO 3D细胞活力测定测定细胞活力。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
图S6：STING-R284S-mRNA-LNP可触发MCC细胞中重要的抗肿瘤细胞因子的产生和细胞死亡。（A） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP处理10e4 MS-1细胞，将其与指定浓度的重组人APOE4蛋白预混合。转染后16h，对细胞进行STING染色（红色）和切割的Caspase-3染色（绿色）。（B-C）10e4 MS-1细胞用1µg STINGWT或STING-R284S-mRNA-LNP，与10µg/ml人APOE4蛋白预混合。转染后16h，STING-WT和STING-R284S表达增加通过RT-qPCR确认（B），并通过RT-qPCR测量所示基因的mRNA水平，并将其标准化为GAPDH mRNA水平（C）。未处理细胞（模拟）的值设置为1。（D） 用1µg STING-WT或STING-R284S-mRNA-LNP处理0.5x10e4 MS-1细胞，并在0小时和24小时与10µg/ml APOE4蛋白预混合。转染后40h，通过滴度测定细胞活力-GLO 3D细胞活性测定。误差条代表三个独立实验的SEM。（ns：不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
综上所述，我们证明STINGR-284S-mRNA-LNP强烈激活癌细胞中的STING信号通路，从而产生关键的抗肿瘤药物细胞因子和癌细胞死亡。
03
结 论
为了克服传统的STING激动剂在STING沉默的癌症中不起作用的局限性，我们探索了在STING沉默的免疫“冷”PDAC中引入天然存在的组成性活性获得功能STING突变体以重新激活抗肿瘤免疫的想法。
结果表明，STINGR-284S -mRNA -LNP可以克服传统STING激动剂的毒性和局限性，因此可以作为一种新的治疗方法，用于治疗一系列对当前治疗无效的STING缺陷型癌症。
