mRNA分子由于疫苗的关系为大众所认识,但是很多人却不知道mRNA疫苗的幕后功臣,甚至可以说是整个机理的关键所在,是将mRNA封装并且安全有效地送进机体细胞的脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle,LNP)。
脂质纳米颗粒 (LNP) 是临床上最先进的非病毒基因输送系统。脂质纳米颗粒能够克服阻挠基因药物研发和应用的一大障碍,安全而有效地输送核酸。基因药物有许多不同的应用领域,例如基因编辑、疫苗的快速研发、罕见遗传病和无成药性疾病的肿瘤免疫治疗,等等;所有这些应用领域通常都会受到核酸输送效率低下的妨碍。相较于此前的脂质核酸输送系统,脂质纳米颗粒具有多项优势,包括:
• 核酸包封率高并且能够有效转染
• 组织穿透性增强,有利于输送治疗剂
• 细胞毒性和免疫原性低
上述特性使脂质纳米颗粒成为出色的核酸输送候选物。
从技术上来讲,核酸药物的研发主要有三个壁垒:第一个是原料端,包括mRNA原料序列的筛选和修饰;第二个是递送系统;第三个是整个药物的生产工艺。目前采用微流控技术产生脂质纳米颗粒(LNP), 将mRNA包裹在LNP 纳米颗粒中,再进入人体, 是FDA唯一批准上市的mRNA传递技术,并且已经在世界各地注射上亿剂的mRNA新冠疫苗中采用,其技术的安全性和有效性已经在这次全球的新冠疫情中得到验证。
君礼生物参照Moderna和BioNtech的新冠疫苗配方,以MC3和SM102为主要脂质,提供制备包载mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。
实验原理
MC3和SM102是两种可解离脂质,在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质,通过静电作用于带负电的mRNA结合,形成载有mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)。在本实验中采用微流控混合法,让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒径均一的LNP。由于脂质溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性缓冲液中,因此需要透析或者超滤去除残余的乙醇并将溶液体系置换至PBS中。
微流控技术基本原理:将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后,将两相溶液注入制备系统的两条入口通道,一端是RNA的水溶液,一端是脂质的乙醇溶液,通过两相的快速混合,完成核酸脂质纳米颗粒的合成。 改变流体注入速度和比率,可以控制脂质纳米颗粒的粒径大小。将各种脂质溶解在乙醇中,mRNA溶于酸性水缓冲液中,将两相快速混合。通过稀释乙醇相,脂质的溶解度降低,在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒,同时高效包载mRNA。再经缓冲液膜包超滤或者透析除去残留的乙醇,中和缓冲液的pH值。
实验步骤
1、配制脂质-乙醇溶液
LNP 的成分与分子量见下表:
百分比来源于前期研究,并不一定与onpattro和mRNA-1273相同。
每种成分别配置三个浓度:8 mM(约5 mg/ml)、12 mM(约7.5 mg/ml)和16 mM(约10 mg/ml)
2、计算mRNA浓度
根据N/P=6,FRR=3计算所需RNA浓度。
RNA的碱基的平均分子量为340,每个碱基携带1个磷酸,因此RNA中的含磷量为3.1 nmol/μg.
计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数,因此每摩尔混合脂质中含有0.5摩尔N。
3、配制mRNA-柠檬酸缓冲液
使用超纯水分别配制100 mM的柠檬酸(分子量:210.14,称取1.05 g)和柠檬酸钠(分子量:294.10,称取1.47 g)溶液各50 ml。
取33.0 ml柠檬酸溶液和17.0 ml柠檬酸钠溶液,混合后加入DEPC,静置30分钟后高压灭菌去除DEPC,灭菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的柠檬酸缓冲液。
将mRNA测定浓度后根据脂质浓度使用柠檬酸缓冲液稀释至所需浓度。
4、微流控混合
①装配设备
②预冲洗管路和微混合芯片
③微流控混合制备LNP
1.分别将分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22微米滤膜过滤。
2.将脂质-乙醇溶液吸入1 ml注射器中(根据需要,至少需要吸入0.5 ml),将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中(至少吸入1.5 ml),并排出注射器中的空气。
3.将注射器出口和样品导入管连接,并固定在注射泵上。
4.用户可根据具体需要来调整注射泵的流速和混合体积。推荐起始设定如下:
5.点击运行,观察流出管流速稳定后(一般需要丢弃前200微升液体),用收集管收集流出的液体。一般在注射结束前1-2秒停止收集,丢弃最后1-2秒流出的液体(若配备自动切换前后废的装置,则需要在软件中设置)。
④透析(或者超滤)与储存
1.样品收集后,立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。
2.使用动态光散射仪测定LNP粒径和均一度。
3.制备后放入透析管中加入14 ml PBS在摇床上透析,2小时后换液,直至18小时后透析结束。一般透析或者超滤后粒径和PDI均会略微增大。
4.保存于含有2%蔗糖的PBS,-80℃冻存。
快速纳米药物制备系统
【实验服务流程】