在过去的十年中，免疫检查点抑制剂（ICI）的研究和使用改变了癌症治疗的方式，提高了多种癌症的总体存活率，例如在恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌的诊疗中便发生了革命性的变化。此外，目前还正在进行大量针对ICI其他适应症的临床试验，包括辅助和新辅助治疗。值得一提的是，对比非肿瘤药物，ICI等抗肿瘤新药研发成功上市率普遍偏低（图1），药物研发企业亟需对药物研发模式进行转变。为了提高药物研发成功率，以生物标志物为核心的转化医学新药研发模式被普遍接受。因此如何在ICI等新药研发中准确检测生物标志物或者发现新的分子标志物用于患者分层，对于提高免疫治疗药物的研发成功率显得尤为重要。

▲ 图1:非肿瘤和肿瘤药物临床研究转化成功率对比

当前临床中常用于评估PD-1/PD-L1抑制剂疗效的患者分层的生物标志物有PD-L1表达（IHC）、微卫星不稳定（MSI）、肿瘤突变负荷（TMB）。然后这些常用的分子标志物在实际的临床应用中常存在局限性。例如在可手术的非小细胞肺癌（I, II, IIIA）新辅助免疫治疗评估中，PD-L1蛋白表达（IHC）无论是高表达还是低表达，其对纳武单抗治疗都产生了疾病缓解(图2)¹。近期也有研究表明TMB并不能作为所有实体瘤预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的分子标志物：例如对于CD8 T细胞水平与新抗原负荷呈正相关的1类瘤种中，如黑色素瘤、肺癌和膀胱癌，高TMB（TMB-H）的肿瘤组接受ICB治疗的ORR为39.8%，显著高于低TMB（TMB-L）的肿瘤组；而在CD8 T细胞水平与新抗原负荷之间无相关性的2类瘤种中，如乳腺癌、前列腺癌和胶质瘤，TMB-H的肿瘤未能达到20％的ORR并且ORR显著低于TMB-L的肿瘤（图2）²。

▲ 图2:PD-L1（IHC）在可手术肺癌和TMB在2类肿瘤作为分子标志物的局限性

值得一提的是，2019年在JAMA Oncol期刊中发表了一项对56篇肿瘤领域文献的荟萃对比研究，共分析了10种实体瘤的共计8135个病例数据，结果表明相对于PD-L1单指标IHC、TMB以及GEP等评估方式，多重荧光免疫组化（mIHC）方法进行治疗前预测的曲线下面积（AUC）显著提高，表明mIHC方法预测抗PD-1/PD-L1治疗的反应更准确。值得一提的是将PD-L1表达（IHC）、TMB以及GEP三个指标联合评估抗PD-1/PD-L1治疗疗效准确性仍然低于mIHC评估方法（图3）³。由此可见，相比于传统免疫组化技术、二代测序技术（NGS）而言，mIHC技术作为抗PD-1/PD-L1药物研发的伴随诊断技术具有明显的准确性优势。

▲ 图3:PD-L1(IHC)、TMB、GEP和mIHC评估抗PD-1/PD-L1疗效的灵敏性和特异性比较

多重荧光免疫组化技术（mIHC），可在一张组织切片上实现7-9种生物标志物的标记，利用人工智能技术将病理医生的判断转化为客观算法，进而对整张切片上的不同的细胞亚型进行识别和统计，该技术在肿瘤免疫微环境表征上具有显著优势（图4）。相较于IHC、qPCR/NGS和流式细胞术等诊断技术而言，mIHC具有能够同时标记与免疫治疗相关的免疫细胞个数信息、空间位置信息和功能信息。

▲ 图3:Akoya多重荧光免疫组化技术平台组成

随着mIHC技术在基础和临床研究中的不断应用，越来越多新的，用于评估抗PD-1/PD-L1药物的预测性生物标志物将被发现。例如近期在Nature期刊上连发三篇关于三级淋巴结构（TLS）在黑色素瘤、肾癌和肉瘤中的免疫治疗领域的研究，共同认为：TLS与免疫治疗的预后密切相关，甚至患者能否能从抗PD-1免疫治疗中获益，可能也取决于TLS的浸润情况^4-6。此外，近期在Nature Cancer期刊上发表的研究（发现队列n=328）探索了TLS状态与免疫治疗应答率、PFS和OS的关系，探究PD-L1表达水平、CD8+T细胞密度与TLS状态的关系。采用多重免疫组化技术（mIHC）结合CD8、CD20、CD21和CD23等标记物判断TLS成熟度，进而系统定量分析肿瘤间质和T细胞浸润；最后在两个验证队列（n=131和n=81）中进行验证。研究表明CD8+T细胞的高浸润与TLS的存在可独立于PD-L1表达，用于预测PD-1抑制剂的疗效，辅助筛选PD-L1表达阴性的获益人群（图4）⁷。

▲ 图4:多重荧光免疫组化技术刻画TLS和TLS与抗PD-1药物疗效关系

综上所述，mIHC是一种较为先进的伴随诊断技术，该技术相较于传统检测技术在识别可能从抗PD-1药物治疗中获益患者、筛选可能增加抗PD-1药物治疗严重不良反应风险的患者以及监测抗PD-1药治疗的反应，调整治疗的时间，剂量或停药等方面，具有更好的实现安全性和有效性。这些将为抗PD-1肿瘤药物研发保驾护航，辅助提高药物研发的成功率。

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