实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。探针类由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但实时荧光定量 PCR则简便易行。

SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520nm。 在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。

TaqMan探针工作原理

分子信标（molecular beacon）工作原理

分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。

如何评估Real-time qPCR定量检测？

一、Real-time qPCR定量方法

可以分为绝对定量和相对定量。

绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。

相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是 2-∆∆Ct 。

1. 绝对定量

Y=-3.432X+34.638;R2= 0.995, E=95%，所以可以进行数据分析。如果未知样品的  Ct=25， 代入方程：25=-3.432X+34.638, 所以：X=2.8 Copies=10^2.8

2. 2-∆∆Ct定量

3. 其他定量方法

二、 影响Ct值的关键因素

1. 模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。

2. 反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响—-比如溶液的pH值和盐浓度。

3. PCR反应的效率

在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

三、如何评估实时定量PCR反应的效果

1.PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5 logs)连续梯度稀释模板浓度。

2. R2值：另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）来准确预测X值（量）。如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99时，两个数值之间相关的可信度很好。

3. 精确度: 标准偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。

4. 灵敏度：无论CT绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。

本文由网络文章综合整理，仅作信息交流之目的，如需删除请联系我们。